弦华生物3S 无缝克隆试剂盒

弦华生物3S 无缝克隆试剂盒

货号:EV0070

英文名称:3S Seamless Cloning Kit

产品规格:10T50T100T
【产品介绍】

无缝克隆技术（seamless cloning）作为一种高效、灵活的分子克隆方法，相较于传统克隆技术具有显著优势。无缝克隆技术通过简化操作流程、提高灵活性和效率，成为现代分子生物学中替代传统酶切连接操作的主流方法。其核心优势在于突破酶切位点限制、正确率及广泛适用性，从而为涉及基因操作的基因表达、蛋白纯化、基因编辑、合成生物学等领域提供了一种高效的研究工具。

本产品是一种即用型的无缝克隆产品。通过同源重组的方法，可以将目的DNA片段按照预定方向、快速、高效和精准地插入到线性化载体中，并且最终构建的克隆中不会引入任何额外的碱基序列。在任何载体中，反应时间短至20分钟，阳性率可达到 95~100%。只需插入的 DNA 片段末端与载体末端具有 15~25个同源碱基序列就可以在载体的任意位点完成克隆重组。

【注意事项】（操作前仔细阅读）

1. 重组反应后的产物不可长时间室温放置，推荐-20℃保存；

2. 试剂盒重组效率较高，感受态转化效率>106 CFU/μg DNA即可，重组产物转化体积最多不应超过所用感受态细胞体积的1/10，即可以得到较好的实验结果；

3. 试剂盒中的含有阳性对照载体和片段，请在收到试剂盒后开始正式实验之前进行测试。

【试剂盒组成】

【标准实验步骤】

1. 线性化载体和片段的制备

1.1 载体制备

1.1.1 线性化载体的获得方式可以通过酶切或者反向PCR。

1.1.2 若通过酶切，请选择合适的克隆位点，对载体进行线性化。推荐尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆。

1.1.3 酶切时建议选用双酶切。若选用单酶切，需延长酶切时间或增加内切酶使用量，以确保载体切开，减少原载体残留，从而提高鉴定结果准确性和正确率。

1.1.4 推荐对酶切或PCR制备的载体进行胶回收，以提高纯度。酶切处理的载体还可根据所用内切酶失活条件进行80℃ 10 min处理后直接进行重组反应，但需确保酶切。

1.2 插入片段制备

1.2.1 引物设计时，请在引物5'端加入包含酶切位点的15~25 bp碱基。引物由5'至3'分别为载体同源臂-酶切位点-基因特异性扩增序列。注：若载体通过反向PCR制备，此时插入片段的引物序列中可不含上述酶切位点。

1.2.2 目的基因的扩增推荐使用高保真聚合酶进行PCR反应。

1.2.3 插入片段的回收可采用胶回收或将反应液进行DpnI处理以消化PCR模板。

2. 重组

请在冰上配置以下反应体系，然后37℃反应15~20min

2.1 重组反应的插入片段与载体的用量为1：1~1：10（质量浓度比）；

2.2 30℃延长重组反应时间至40分钟，可提高重组效率，获得更多克隆；

2.3 重组后的体系，若不立即转化，可在-20℃放置至多1周。

3. 转化

   请将重组产物通过标准的化转或电转操作进行转化。

弦华生物3S 无缝克隆试剂盒【存放说明】

-20ºC保存，至少一年有效。可以分装后在-80ºC长期保存。